因为在多次推迟考试时间后，宇智波佐助仍未赶来赴考，所以一度想取消其资格，但因“风影”劝他多等一回而打消念头。后宇智波佐助与我爱罗进行对战期间，我爱罗忽然在这个时候人性全失。而音隐及砂隐村此时亦开始对木叶隐村发动攻击。“风影”和他的部下把三代目火影捉到桔梗城楼之上，风影亦露出他的真面目，原来就是自己的学生——大蛇丸。大蛇丸的部下“音忍四人众”更在城楼上结出“四紫炎阵”，把大蛇丸及三代目火影围起来，作为他们对战的地方，而结界所生之火焰令木叶暗部无法进入。三代目知道要逃出此阵不是一件容易的事。大蛇丸在对战前曾一度流下泪来，三代目认为杀害老师的他还是会伤心，大蛇丸则声称只是打呵欠才流泪，令在场的卡卡西、阿凯和暗部傻眼，随后向三代目火影发出挑战（有别于其手下药师兜在第二场中忍考试向第七班强调出其不意的偷袭才是忍者的作法）
……
战斗一开始，三代目使用“忍术·瓦片手里剑”攻击大蛇丸，但轻易被大蛇丸躲过，对方还以颜色、以“潜影蛇手”袭击他;不过这只是他的“土替身”。三代目之后以“土遁·土流大河”、“土遁·土龙弹”及“火遁·火龙弹”袭击大蛇丸，但大蛇丸不是泛泛之辈，虽然不敢再轻视三代目，但亦扬言自己不过这么简单被解决。大蛇丸要求三代目认真决战来个了断，三代目亦“应邀”脱去火影制服，显露其忍者战装。不过，就在三代目使用“手里剑影分术”之时，大蛇丸终于使用秽土转生，把千手柱间及千手扉间召唤出来;更一度欲把四代目也召唤出来，但四代目曾使用尸鬼封尽故灵魂已由死神保管无法召唤。面对自己的两名老师，三代目也知情况艰难，指责大蛇丸竟然还愚弄死去的两名火影，要他们死去后还需战斗。
大蛇丸在两名火影头上插入符咒后，他们会回复**，但已失去任何意志，只是任大蛇丸操控的傀儡而已。初代及二代目首先奔往攻击三代目，被三代目击开、及再以“火遁·火龙炎弹”攻击他们。面对火的攻势，擅长水遁的二代目在没有水的情况下，仍能施展“水遁·水阵壁”阻挡，再反过来以“水遁·水冲波”做成巨浪准备淹盖三代目。三代目随即利用“土遁·土流壁”筑成巨岩阻挡洪水;但就在从岩石返归城楼上之际，先后被初代拳打脚踢及被二代目拉进水里，在挣脱下才逃回土壁之上。二代目继续向土壁上的三代目攻击，射出水柱击溃土壁，三代目再度落在城楼之上。此时初代不甘示弱，展现其“血继限界·木遁”，使出“木遁·树海降临”之术，在城楼上长出树木牢牢抓住三代目。三代目无法解开树枝的缠绕，于是以“通灵”召唤出战友“猿猴王”猿魔，并令其化为“金钢如意棒”斩断缠绕着的树枝。
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得到友魔“猿猴王”猿魔的协助，三代目使用其化成的“金钢如意棒”作为武器，跟大蛇丸从口中拿出的“草薙之剑·空之太刀”对战，一度难分高下。但随即初代及二代目纷纷来犯，他没法同时对战三人，只好在初代及二代肢体上留下引爆符，就即被大蛇丸踢飞。大蛇丸一度走近被击于城楼面上的三代目，称对其表示失望，三代目亦一度因为想起童年的大蛇丸而流泪起来。但不久三代目即重拾战意，以敏捷身手攻击大蛇丸，猿魔亦从如意棒中把手伸出、并欲勒死大蛇丸。大蛇丸即时化为泥泞以逃出猿魔的掐杀，并向三代目展示自己脸皮底下的第二真面目--就是利用“不死转生”、而成功侵占**的年轻女忍者面孔。大蛇丸表示这只是他第二次转生的容器，而下一个目标就是拥有写轮眼的宇智波佐助。
三代目后引爆初代及二代目身上的引爆符，以顺利阻止两者的攻击，然而他们“秽土转生”的**可立即修补过来。修复身躯后的两名火影，即对徒儿继续攻击。初代使用木遁术欲再抓击三代目，但幸亏猿魔化成“金钢牢壁”及时保护他。初代亦使用“黑夜行”，使三代目处于黑暗环境当中，并受其攻击。三代目无可奈何下，决定分出两个影分身，再由两个分身份别对初代及二代目施行禁术尸鬼封尽。初代及二代目被封印时，对伤害三代目之事表示遗憾;而在他们消失后，三代目却惊觉原来是两名音忍─萨克·镫及琴·锤被当作牺牲品、以施行“秽土转生”这种禁术。这对一向视生命为至贵的三代目来说，实在不可原谅，更决心要把这个叛徒杀掉。
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他召来金钢如意棒，把大蛇丸手中的草薙剑打飞，并在接近大蛇丸的情况下再次施行尸鬼封尽;而大蛇丸使出“潜影蛇手”欲缠着三代目，但却缠着了其通灵兽猿魔。他对大蛇丸称此术不单施术者灵魂会被死神吞噬而死亡，被施术者也要永远活在死神体内受尽折磨。大蛇丸看见死神心也慌了，召回被击飞的草薙剑从后偷袭三代目。猿魔见状本想握住飞往三代目的剑，但因身体被蛇缠绊著，当它拿到时已有一半刺穿三代目的身躯。双方一度对峙不下，大蛇丸不断用剑贯穿三代目的身躯，而三代目亦不断尝试不大蛇丸的灵体从身躯扯出来。最后因为三代目自知力量不够，已无能力把大蛇丸整个灵体抽出，故决定只透过死神把大蛇丸双手废去，使其永远不能结印以使用忍术。他深信木叶“火之意志”一定会继承下去，所以倒下时仍带着微笑、及再次看到童年的大蛇丸，接着便一睡不起。他的召唤兽猿魔因为失去召唤者亦瞬间消失了，大蛇丸也因失去战斗能力、在音忍四人众保护下离去。